KTV Xét nghiệm Sài Gòn chia sẻ về các phương pháp miễn dịch được sử dụng phổ biến

Xét nghiệm miễn dịch là xét nghiệm dựa trên phản ứng kết hợp giữa KN và KT để tạo nên phức hợp KN-KT. Vậy có các phương pháp miễn dịch gì thường được sử dụng trong phòng xét nghiệm.

• Các phương pháp xét nghiệm Y học giúp chẩn đoán bệnh ký sinh trùng


• Tuyển sinh Cao đẳng Kỹ thuật xét nghiệm Y học Sài Gòn

Bài viết này các bác sĩ giảng viên Trường Cao đẳng Dược Sài Gòn sẽ chia sẻ về các phương pháp miễn dịch thường sử dụng trong phòng xét nghiệm hóa sinh bao gồm:

• Miễn dịch đo độ đục


• Miễn dịch hóa phát quang


• Miễn dịch điện hóa phát quang

Phương pháp miễn dịch đo độ đục (Định lượng Lambda)

Nguyên lý: Dựa trên nguyên lý kháng nguyên kết hợp với kháng thể tạo thành phức hợp miễn dịch kháng nguyên - kháng thể kết tủa làm thay đổi độ đục của dung dịch. Đo độ đục của dung dịch ở bước sóng xác định. Sự tăng độ hấp thụ quang tỷ lệ với nồng độ chất cần đo.

Phân loại:

• Phản ứng định tính: Được thực hiện với huyết thanh pha loãng hoặc không pha loãng. Kháng thể và kháng nguyên được trộn với nhau và quan sát kết tủa tạo thành. Cũng có thể cho kháng thể vào một ống nghiệm nhỏ rồi sau đó cho kháng nguyên dần dần vào theo thành ống. Một vòng kết tủa được quan sát ở mặt phẳng phân cách.


• Phản ứng định lượng: Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết. Cho một lượng huyết thanh vào dung dịch phản ứng để tạo phức hợp KN-KT và định lượng bằng phương pháp đo độ đục để xác định lượng kháng thể (kháng nguyên) đã phản ứng có trong mẫu thử.

Ứng dụng: Định lượng các chất có trọng lượng phân tử không quá nhỏ như: CRP, IgA, IgG, IgM, Microalbumine, Pre-albumin….

Phương pháp miễn dịch hóa phát quang (Chemiluminescent Immuno Assay: CLIA)

Nguyên lý: Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang dựa trên nguyên lý kháng nguyên (chất có trong mẫu bệnh phẩm) kết hợp với kháng thể (chất có trong thuốc thử) có gắn chất đánh dấu (thường là phân tử Acridinium Ester) Nhờ chất đánh dấu có khả năng phát quang khi thay đổi pH của dung dịch phản ứng và tín hiệu phát quang được khuếch đại qua một ống nhân quang mà người ta có thể định lượng các chất có nồng độ rất thấp hoặc các chất bất thường trong cơ thể với độ chính xác rất cao so với các kỹ thuật hóa sinh thông thường khác. Phân tử Acridinium ester có trong lượng phân tử nhỏ hơn rất nhiều so với các enzyme trong phản ứng ELISA do đó tăng khả năng thâm nhập vào cơ chất và giảm thiểu hiệu ứng che lấp trung tâm hoạt động của KN và KT do đó độ chính xác tăng đáng kể so với phương pháp ELISA (đặc biệt khi định lượng những chất có nồng độ thấp)

Ứng dụng: Hiện nay, xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang đã được thực tế và công nghệ chứng minh là kết quả xét nghiệm chính xác hơn, dải đo rộng không cần pha loãng mẫu và nhạy hơn các phương pháp ELISA, EIA, FEIA đo màu thông thường và không cần ủ lâu. Các CLIA Kits được thiết kế để phát ánh sáng dựa trên phản ứng hóa phát quang. Các bộ xét nghiệm CLIA có một phạm vi hoạt động xét nghiệm rộng hơn, độ nhạy cao và nhanh hơn so với các phương pháp ELISA

Theo bác sĩ giảng viên tại Trường Cao đẳng Dược Sài Gòn, các xét nghiệm miễn dịch hóa phát quang đã được sử dụng để phân tích nhiều hợp chất có tầm quan trọng như dược phẩm, hormon và các marker sinh học khác

Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (ECL: Electrode Chemi Luminescence)

Nguyên lý: Kỹ thuật điện hóa phát quang sử dụng chất đánh dấu Ruthenium khởi phát từ điện chứ không phải từ phản ứng hóa học, vì vậy có khả năng phát hiện chất có nồng độ thấp và cho kết quả rất nhanh.

Công nghệ ECLIA là kỹ thuật hiện đại sử dụng chất đánh dấu là Ruthenium(II)-tris(bipyrrydyl) [Ru(bys)32+] và Tripopylamine (TPA). Khi phức hợp kháng nguyên - kháng thể có gắn chất đánh dấu được gắn lên bề mặt điện cực thì quá trình khởi động điện bắt đầu. Dưới tác dụng của dòng điện có điện áp 2V, hợp chất phát ra photon ánh sáng và giải phóng electron quay trở lại bám trên bề mặt điện cực. Cường độ ánh sáng tỷ lệ với nồng độ chất cần phân tích và là cơ sở cho việc tính toán nồng độ chất cần đo. ECLIA đã khắc phục nhược điểm của hóa phát quang (Chemiluminescence) bằng cách sử dụng dòng điện để dễ dàng chuyển phân tử Ruthenium sang trạng thái kích thích do mất electron, ở trạng thái này phân tử Ruthenium phát quang.Do đó điện hóa phát quang có độ nhạy và đặc hiệu cao hơn hóa phát quang. Đặc biệt với nguyên lý cạnh tranh khi sử dụng chất đánh dấu gắn lên chất cần đo ( Kháng thể đơn dòng ) đã giúp cho kết quả xét nghiệm sử dụng công nghệ ECLIA có độ chính xác và tin cậy rất cao.

Phân loại: Miễn dịch điện hóa phát quang sử dụng 3 loại nguyên lý gồm: nguyên lý Sandwich; nguyên lý cạnh tranh; nguyên lý bắc cầu

Nguyên lý Sandwich

Các giai đoạn:

• Giai đoạn 1: Kháng thể gắn Biotin được cho vào để tác dụng với kháng nguyên (Chất cần định lượng) có trong mẫu bệnh phẩm tạo phức hợp KN-KT*


• Giai đoạn 2: Cho tiếp kháng thể gắn chất phát quang Ruthenium vào để tạo phức hợp *KT-KN-KT*


• Giai đoạn 3: Cho vi hạt Streptavidin là một chất có ái lực rất lớn với Biotin vào phản ứng. Ngay lập tức nó sẽ gắn vào Biotin tạo phức *KT-KN-KT**. Sau đó toàn bộ phức hợp được đưa vào buồng đo. Tại đây vi hạt Streptavidin sẽ được bắt giữ với pha rắn trên thành buồng đo nhờ lực hút tĩnh điện.


• Giai đoạn 4: Cho dung dịch rửa vào rửa sạch tất cả các chất không được bắt giữ. Trong buồng đo chỉ còn phức hợp *KT-KN-KT**. Lúc này cho điện áp vào điện cực thì Ruthenium sẽ phát quang và được đo qua hệ thống ống nhân quang. Cường độ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ chất cần đo. Do sử dụng công nghệ khếch đại ánh sáng nên phép đo có độ chính xác rất cao

Ứng dụng: Dùng cho việc phân tích những chất có kích thước vô cùng nhỏ như: FT3, FT4, Cortisol, Testosterone, Estradiol, Progesterone...

Nguyên lý cạnh tranh

Các giai đoạn:

• Giai đoạn1: Kháng thể gắn chất phát quang được cho vào để tác dụng với kháng nguyên (Chất cần định lượng) có trong mẫu bệnh phẩm tạo phức hợp KN-KT*


• Giai đoạn 2: Thêm KN gắn Biotin vào để tạo phức hợp *KN-KT*


• Giai đoạn 3: Cho vi hạt Streptavidin vào phản ứng tạo phức **KN-KT*. Sau đó toàn bộ phức hợp đi vào buồng đo. Tại đây phức **KN-KT* được bắt giữ


• Giai đoạn 4: Cho dung dịch rửa vào rửa sạch tất cả các chất không được bắt giữ. Trong buồng đo chỉ còn phức hợp **KN-KT* . Lúc này cho điện áp vào điện cực thì Ruthenium sẽ phát quang. Cường độ ánh sáng tỷ lệ nghịch với nồng độ chất cần đo do đó nếu nồng độ càng nhỏ thì cường độ ánh sáng càng lớn. Đây là ưu điểm vượt trội của phương pháp cạnh tranh

Ứng dụng: Dùng cho việc phân tích những chất có kích thước lớn hơn như: TSH, FSH, LH, βhCG, insullin, C-peptid, Ferritin, troponin T, HBsAg, PSA, AFP, CEA, CA125, CA19-9, CA15-3, CA72-4…

Nguyên lý bắc cầu

Nguyên lý bắc cầu tương tự nguyên lý Sandwich nhưng khác biệt ở chỗ kháng thể đánh dấu có thể tạo liên kết với phức hợp KN-KT* bên cạnh vì có nhiều vị trí tạo liên kết do đó tạo thành phức hợp KN-KT lớn dễ dàng cho việc đo cường độ ánh sáng phát quang. Tuy nhiên do sử dụng KT đa dòng nên tính đặc hiệu sẽ giảm. Thường dùng để định lượng kháng thể.

Ứng dụng: Dùng cho việc phát hiện những kháng thể trong mẫu thử như: IgG, IgM, IgA…